Inmunocitoquímica

Conteo de neuronas inmunorreactivas a TH en un área de 1500 μ².

Conteo de células inmunorreactivas a GFAP en un área de 3300 μ².

Se hacen cortes histológicos del mesencéfalo ventral (SNc de entre 50-100 μm). Posteriormente se hacen lavados sucesivos en el siguiente orden: En amortiguador PBS 3 veces por 10 minutos; 3 lavados en amortiguador TRIS de 10 minutos; amortiguador TRIS y peróxido de hidrógeno 0.3 % (30 minutos); amortiguador TRIS y borohidrido de sodio 0.01 % (30 min); amortiguador TRIS con 1 % de suero normal de cabra y 0.3 % de tritón (durante 1 h), todos con agitación, posteriormente se incuban los cortes en una alícuota de anticuerpo primario anti-TH en amortiguador TRIS 1:1000 con 1 % de suero normal de cabra por 3 días a 4 ºC. Posteriormente se lavan los cortes 3 veces en amortiguador TRIS con 1 % de suero normal de cabra durante 10 min con agitación. Se incuban por 2 horas a temperatura ambiente en el anticuerpo secundario. Anti-IGg de conejo 1:200 en TRIS con 1 % de suero normal de cabra. Se hace un lavado en TRIS con 1 % de suero normal de cabra, para después incubar en Abidina-Biotina (2 Hrs) a temperatura ambiente. Después de 3 lavados en TRIS con agitación se revela la tinción en los tejidos con 3-3 Diaminobencidina (DAB) al 0.05 % y 0.003 % de peróxido de hidrógeno. El tejido se lava una última vez en TRIS por 10 min y se montan en portaobjetos previamente gelatinizados, se dejan secar un día. Para cubrir con resina se realiza la deshidratación de los cortes con alcoholes en concentraciones crecientes (60, 70, 80, 90 y 96 %) diez minutos en cada uno y 3 cambios en alcohol de 100 % de 10 min y finalmente dos cambios en tolueno de 10 min cada uno. Para su posterior análisis en un fotomicroscopio, haciendo un conteo de las neuronas inmunorreactivas a TH en la SNc en un área de 1500 μm² en 10 cortes por animal a partir del inicio del núcleo terminal medial del tracto óptico accesorio.

Para la inmuno de GFAP o Neu-N o cualquier otra el procedimiento es el mismo lo que cambia es el anticuerpo primario.