DETERMINACION DE PEROXIDACION DE LIPIDOS POR ACIDO TIOBARBITURICO (TBA)
Para esta técnica en ratas de aprox. 250 grs. Se emplean 5 animales por grupo.
Los animales son decapitados y se extraen los núcleos, juntando el tejido de los 5 organismos en un tubo eppendorf se mantienen en congelación a -70ºC hasta el momento de su uso.
Cálculos de los reactivos (que se preparan al momento) para 40 tubos.
En tubos de ensayo
1. Agregar Malonaldehido (Curva de calibración) o tejido:
Curva de calibración
Malonaldehido 164 mg/ml. Preparar antes de usar
Obtener una dilución de 1:1 000 000:
1µl de malonaldehido puro +999µl de H2O bidestilada (dilución 1)
1µl de la dilución 1++999µ de H2O bidestilada (dilución II)
Tubo µl de malonaldehido (dilución II)
10
25
310
425
550
6100 Hacerlo por duplicado o triplicado
Tejido (Homogeneizar con salina 0.9%)
Estriado: 50 μl SN: 40μl GP: 40 μl
Colocar la muestra en tubos de ensayo por triplicado: Est: SN: GP:
2. Tubos en hielo, adicionar 50 µl de BHT a cada tubo. (8 mg de BHT en 2 ml metanol absoluto, preparar al momento).
3. Añadir 1ml de amortiguador: fosfato de potasio monobásico (KH2PO4 0.15M, pH7) Preparar antes (Para 100 ml, pesar 2.04 g de KH2PO4, ajustar a pH7 con NaOH) Agitar
4. Incubar en baño maría a 37ºC por 30 min. Mientras, preparar otro baño maría (cristalizador) calentar a punto de ebullición.
5. Agregar 1 ml de ácido acético al 20% (Colocar 20 ml de acético y aforar a 100 ml con agua destilada. Preparar previamente. Poner en hielo.
6. Añadir 1.5ml de ácido tiobarbitúrico (TBA) al 0.8%, preparar antes de usar. Agitar en vortex—Calentar
7. Colocar en baño maría en ebullición 45-60 min.
8. Colocar los tubos en hielo. Agregar 1 ml. de cloruro de Potasio al 5% ( 5 grs. KCl en 100 ml. de H2O destilada. Preparar previamente.
9. Añadir X ml de butanol, agitar en vortex
10. Centrifugar a 2000 rpm/5 min Recuperar la fase superior y leer en cubetas de cuarzo a 532 nm.